1. 서 론
신경세포를 이용한 손상된 신경의 재생치료는 세포생 물학, 유전학, 재료공학, 전자공학 등 다양한 연구분야에 서 관심을 갖는다. 이는 알츠하이머나 파킨슨 병과 같 은 신경 질환뿐 만 아니라 외상성 손상에 의한 중추 신 경계의 재생을 포함해서 새로운 치료방법으로 활용될 수 있다.1,2) 신경 조직 공학은 빠르게 확장되는 연구 분야 로서 신경 복구 및 재생에 대한 융합학문을 통한 새롭 고 다양한 방법들이 꾸준히 제시되고 있다.3) 특히 심각 한 손상의 경우 신경의 재생을 유도하거나 신경세포의 성장이나 활성 등을 촉진시킬 수 있는 신경도관 등을 이 용한 방법이 신경조직공학에서 매우 효과적인 결과를 얻 으면서 생체재료의 적용이 매우 활발하게 이루어지고 있 다.4-6) 조직공학을 위해서는 적합한 세포부착/증식/이동을 위한 지지체의 설계 및 제작이 필요하고 그 표면은 세 포와 지지체의 상호 작용이 가능해야 한다.7,8) 이에 신 경조직공학관련 소재들은 신경세포의 주된 기능인 시냅 스전달을 보조할 수 있도록 전기전도성을 부여하거나, 신 경돌기의 활발한 성장을 위해 배양된 형태를 갖도록 발 전되어 왔다.9)
전기방사는 수 나노부터 수 마이크로의 크기의 섬유를 다양한 재료를 이용하여 만들 수 있는 제조 방법으로 일 방향성을 갖는 섬유형 필름을 제작하는데 아주 용이한 공정법 중 하나이다.10,11) 이러한 전기방사 섬유는 세포 의 3차원 다공성 구조인 세포 외기질과 유사하여 세포 부착에 유리하고 물질의 순환이 용이하여 세포의 활성 을 촉진하는데 매우 우수한 환경을 제공한다.12) 일반적 으로 휘발이 용이한 유기용매에 고분자 기반물질을 용 해시켜 섬유형 필름을 제조한다. 기반물질로 많이 사용 되고 있는 생체고분자에는 콜라겐, 젤라틴, PCL 등이 있 다. 이들은 생체 적합성 및 생분해성이 우수해 세포와 의 친화력이 있고, 체내에서 차폐나 조직재생 유도 후 자연스럽게 분해되기 때문에 조직재생 의료용 생체재료 로 각광받고 있다.13) 하지만, 생체고분자로만 구성된 섬 유는 강도나 강직성, 친수성 등의 물성이 보완되어야 할 필요성이 있다. 따라서 강한 생체세라믹스와 복합화를 통 해 기계적/물리적 특성의 한계를 극복하거나 새로운 특 성의 부여로 보다 향상된 기능을 갖는 조직공학체를 제 조하려는 연구들이 수행되었다.14-16)
그라파이트에서 분리한 그래핀은 2차원의 판상형 구조 로 높은 강도와 단위질량당 매우 높은 표면적, 우수한 전기전도성과 생체적합성 특성으로 다양한 생체의료용 분 야에서 활발하게 연구되고 있다.17) 많은 복합체 연구들 에서 그래핀은 기계적인 특성의 향상을 이끌기 위한 보 조적인 역할을 매우 효과적으로 수행하고, 그들의 우수 한 전기전도성을 이용하여 신경이나 근육조직의 재생을 촉진한다는 연구가 보고되고 있다.18,19)
본 연구에서는 그래핀의 다양한 조성을 함유하는 전기 방사형 섬유 필름을 제조하고, 그들의 물리, 기계, 생체 적 특성을 분석하여 적절한 조직공학적 적용에 대한 소 재의 정보를 제공하기 위한 연구를 수행하였다. 특히 그 래핀에 의한 전도성의 향상의 여부와 이를 이용한 신경 조직공학적 적용가능성을 확인하기 위해 신경세포를 이 용한 생체적합성을 평가하였다.
2. 실험 방법
2.1 재료 준비
본 실험에 필요한 시약들의 구입정보는 다음과 같다. Polycaprolactone (PCL; Mn = 80 000 Da, Sigma-Aldrich, USA), PCL 용매제인 tetrahydrofuran (THF, Duksan, KOR), 그래핀(graphenesupermarket, USA) 아세톤 (99.6 %, VWR International AB, SWE), 에탄올(99.6%, CCS Healthcare AB, SWE), Fatal Bovine Serum (FBS, Gibco, USA), Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM, Welgene, KOR), Penicillin-Streptomycin (Merck Millipore, DER), L-glutamine (Merck Millipore, DER), Paraformaldehyde (PFA, Sigma Aldrich, USA), Triton X-100 (Sigma, USA), Phalloidin Alexa Fluor 488 (Invitrogen, Molecular probes, USA). MTS Cell Viability Assay (Thermo Scientific, USA).
2.2 전기방사 실험
PCL은 10 % (w/v)의 농도로 THF에 일정한 자기 교 반 하에 용해하여 준비하고, 그래핀은 미리 THF에 담 구어 용매제가 충분히 스며들 수 있도록 24시간 동안 상 온에서 전처리 하였다. PCL에 함유될 그래핀을 1 ~ 75% 까지 변화를 주어 준비하였다. 자세하게, 10 % PCL 용 액을 각 조성별로 25 ~ 99 mL (75 % ~ 1 % G)를 각각의 유리 vial에 분주하고 모든 조성에서 적용된 THF의 총 량이 100 mL가 되도록 그래핀 분말을 그래핀 전처리용 THF 량의 용액과 혼합한다. 그 후 준비된 PCL 용액과 섞고 강한 교반을 하여 전기방사용 복합체 용액을 마련 하였다. 나노섬유의 전기방사를 위해 준비된 G/PCL 복 합물질 용액은 22G 금속 바늘(Nordson EFD)이 장착된 1 mL 파이렉스 실린지에 실렸다. 이 용액은 전위가 15 kV로 설정된 HCP 35–35000 DC 전원 공급 장치(FUG) 와 실험실 주사기 펌프(알라딘-1000; World Precision Instruments, USA)를 사용하여 3 mL/h의 유속, 20 cm의 작동 거리에서 전기방사를 수행하였다. 알루미늄 포일로 덮인 실린더(Δ = 15 cm)를 회전시켜 방사된 섬유를 수집 하였다. 모든 전기방사는 상온(RT)과 30 ~ 35%의 상대 공기 습도에서 수행되었다. 전기방사된 섬유타입의 필름 은 세포배양 전에 최종적으로 24시간 동안 건조기에 넣 어 남아 있는 모든 용제를 제거하도록 하였다. 제조된 그래핀과 PCL 복합물질은 G/PCL 로 명명하였다.
2.3 전기방사 섬유형 필름의 특성 분석
G/PCL 복합체 섬유형 필름의 그래핀 함유량에 따른 미 세구조와 형태를 확인하기 위해 전자주사현미경 (Mira3, Tescan, Czech)을 이용하였다. 필름 내의 함입된 그래핀 의 확인은 투과주사현미경 (EM-F200, JEOL Ltd, Japan) 분석을 통해 진행하였다. 인장강도 측정은 필름을 10 mm × 25 mm 크기로 준비하고 cross-head의 속도를 10 mm/ min으로 설정하여 a universal testing instrument (Instron 5565, USA)로 측정하였다. Stress-strain curve를 통해 인 장강도, 인장변형률, 탄성계수, 인성을 계산하였다.
2.4 전기저항성 측정
전기저항 특성은 G/PCL 복합체의 그래핀 함유량에 따 른 전기적 특성을 측정하기 위해 수행되었다. 저항측정 은 우선 치밀한 필름과 전기방사 섬유형 필름, 이렇게 두 가지 형태의 필름을 제조하고, 평균두께 1 mm, 크기 가 20 mm × 20 mm인 시편을 준비한다. 저항성 측정을 위해 양 끝단에 실버페이스트를 발라 전극을 만들어주 고, 이 부분을 클램핑하여 전기저항을 측정한다(16008B High Resistance Meter, Agilent).
2.5 세포 부착 및 증식
G/PCL 복합체 섬유형 필름의 생체적합성을 확인하기 위해 PC12를 이용하여 부착 및 증식 실험을 진행하였 다. PC12는 백서에서 유래한 PC-12 세포주로 American Type Cell Collection (Rockville, MD, USA)에서 구입 하여 사용하였다. 10 mm 펀치로 모양을 내어 얻어진 필 름들을 세포배양 well에 넣고 PC12를 분주하여 24 h 배 양하였다. 세포 배지는 1 % (P/S) penicillin/streptomycin 과 10 % FBS을 넣은 DMEM을 사용하였다. 세포증식실 험을 위해서는 3일에 한 번씩 배지를 교체해주었다. 세 포 부착 확인을 위해 4 % PFA로 15분간 세포를 고정하 고 세척 후 0.1 % Triton X-100에 5분 반응 후 Alexa 488을 염색하여 공초점 현미경을 통해 확인하였다. 세포 증식 실험은 정해진 시일에 맞춰 배양된 세포를 PBS로 세척 후 MTS 시약을 처리하고 1 h 후에 490 nm에서 측 정하였다.
3. 결과 및 고찰
3.1 G/PCL 복합체 전기방사 섬유형 필름의 제조
그래핀의 함유량이 증가되면 전기방사 용액의 점도나 전도성 등이 급격하게 변하기 때문에 최대 75 %의 그 래핀이 함유된 조성까지 전기방사 섬유형 필름이 제작 가능했다. 하지만 75 % 이상의 조성은 그래핀 입자의 뭉 침현상도 발생하지만 전기방사 중에 실린지 끝단에 누 전과 같은 현상이 발생되어 섬유가 만들어지는 과정 중 에 비드가 빈번하게 만들어지는 경향이 있었다.
일반적으로 전기방사가 진행될 때 실린지 팁부분에서 표면장력으로 인해 콜렉터 방향으로 taylor cone이 형성 되고 여기서 필라멘트가 발생하여 초기엔 ohmic flow 거 동에서 convective flow로 진입하며 솔벤트의 휘발과 섬 유의 solid화가 완성된다. 그래핀에 의한 전도성의 증가 는 전하밀도를 증가시켜 미세한 섬유는 얻는데 도움을 줄 수 있지만, 너무 놓은 전하밀도는 jet flow가 분기되 어 splaying이 생기고, 매우 요동치는 convective flow가 발생하여 배열된 섬유의 collection이 어렵게 된다. 그래 서 75 %의 그래핀이 함유된 섬유는 섬유형 필름을 제 조는 가능하나, 그 섬유의 두께 및 조성 균일성이나 배 열성 등이 매우 열악하게 제조되었다.
3.2 기계적 특성
PCL기반의 그래핀 복합체 섬유형 필름의 기계적 특성 을 측정하기 위해 Fig. 2(a)에서 보이는 바와 같이 아령 모양의 샘플을 준비하였다. 하얀색의 PCL 필름은 그래 핀의 양이 증가함에 따라 검은색을 띄며 진해지는 것을 확인할 수 있다. 제조된 필름의 연신특성은 0 % G 보 다 1 % G에서 2배 이상 늘어나는 것을 육안으로 확인 할 수 있었다[Fig. 2(b)]. 5 % 이상에서는 연신율이 감 소되는 경향을 보였다. 측정된 인장강도의 결과는 Fig. 2(c)에 나타낸 stress-strain curve를 통해 전반적인 경향 이 확인되었고, 이를 바탕으로 강도, 연신율, 탄성률, 인 성이 측정되었다(Fig. 3). 그래핀의 높은 기계적 강도나 탄성률에 의해 그 함량이 증가함에 따라 강도와 탄성률 이 증가될 수 있다. 하지만 25 % 이상의 그래핀 함유 는 기계적 물성의 강화에는 긍정적인 결과를 이끌지는 못했다. 이 조성에서는 PCL간의 연결을 그래핀이 방해 하는 역할을 하는 것으로 사료된다. 복합체 제조에서 일 정성분 이상으로 보강제의 조성이 증가되면 동질 물질 간의 aggregation zone의 발생으로 강도, 연신율 등 기 계적 강도가 급격히 감소하는 현상이 나타날 수 있다.20) 그렇기 때문에 작은 나노크기의 입자와의 복합화 혹은 매우 균일한 보강제의 분산을 이루는 복합체 제조 방법 등에 관한 연구들이 수행되는 것이다. 본 연구에서는 그 래핀의 분산친화력을 높이기 위해 THF 용매에 그래핀 을 미리 분산시켜 용매의 침습이 용이하도록 하여, THF 에 용해되어있는 PCL과의 혼합을 고르게 유도하였다. 하 지만 75 % 이상의 그래핀 함유조성에서는 그래핀간의 뭉 침현상을 제어하기가 어려웠기에 그 섬유형태도 불균일 하고, 이로 인해 기계적 특성이 일관성 없이 오차가 너 무 크게 측정되었다. 따라서 본 연구에서는 75 % G/PCL 복합체의 제시된 데이터가 없다. 다만 고함량의 그래핀 조성은 기계적 특성을 이용하는 타겟보다는 전도성이 요 구되는 타겟에 더 적합한 조성이라고 판단된다.
3.3 복합체의 전기적 특성
그래핀이 함유되어 있는 재료의 전기적 특성을 평가하 기 위해 재료의 저항이 측정되었다. 절연특성의 PCL 생 체고분자가 기반물질이기 때문에 그래핀에 의한 전도성 이 부여되더라도 G/PCL 복합체는 매우 낮은 전기 전도 성을 가질 것이라 예상된다. 이에 고저항기를 이용하여 샘플들의 저항을 측정하고 이 수치를 그래핀 조성에 따 른 전기적 특성으로 고려하였다. 본 연구에서 제작된 섬 유형 필름은 일방향성과 그들의 나노크기의 모폴로지와 다공구조로 세포와의 친화력이나 세포성장 방향 유도성, 물질의 침투력 향상 등의 장점을 갖는다. 하지만 물리 적인 특성인 전기적인 전도성 측면에서 고려해보면, 섬 유사이의 다공구조는 절연특성을 강화시키는 역할을 할 수 있다.21) 미시적인 스케일의 환경에 존재하고 거동하 는 세포는 복합체의 섬유하나를 통해 부착하고 이동하 고, 분화할 수 있다. 따라서 복합체를 구성하는 조성이 갖는 생체적합성이나 물리적 특성 등이 영향을 줄 수 있 지만, 거시적인 관점에서 고려되는 섬유형 복합체 사이 의 기공구조로 인한 절연은 고려되지 않는다. 그래핀에 의한 전도성의 향상을 측정하기 위해 그래핀 조성에 따 른 복합체 단섬유 하나를 이용하여 전기적 특성을 측정 하는 것이 가장 이상적이며 적합한 방법이겠으나, 다른 대안으로 치밀한 필름이나 막구조의 샘플을 제조하여 성 분조성에 따른 전기적 특성의 평가를 진행하는 것도 가 능하다. 따라서, 본 연구에서는 복합체의 전기적 특성을 치밀한 필름으로 제조한 샘플을 이용하여 측정하였다. Fig. 4(a)의 그래프는 PCL에 복합화된 그래핀의 농도 따 른 G/PCL 복합체 필름의 전기 저항성 결과이다. 그래 핀이 질량비로 10 %까지 함유된 샘플에서는 저항이 매 우 크게 나타났고, 25 % 이상의 그래핀 함유 조성에서 부터 전기적 특성이 향상되는 결과가 보였다. 전기저항 이 25 %, 50 %와 75 % 그래핀 함유 복합체에서 각각 1 × 103, 5.3 × 102, 0.37 Ωm의 수치로 측정되었다. 75 % 의 조성은 전기방사형 섬유로 제작하기에 그래핀들의 aggregation 등이 많이 발생하고 PCL용액의 점도가 낮 아지는 경향이 나타나 섬유를 제작할 때 균일하지 못한 모폴로지와 다른 조성에 비해 비교적 얇은 나노섬유의 형성을 보였다. 75 % 그래핀 섬유 복합체는 형태적 관 찰이나 기계적 특성의 평가에서 좋지 못한 특성들을 보 였기 때문에 앞선 연구 평가에서 배제된 조성이었다. 하 지만 전기전도성 측면에서는 예상대로 전도성이 매우 뛰 어나게 증가되었다. 여기서 본 연구에서는 치밀한 형태 가 아닌 기공이 존재하는 섬유형 필름에서의 전기전도 성은 어떻게 변화되는지 관찰하기 나타나는지도 관찰하 였다. Fig. 4(b)는 75 % 그래핀 함유 PCL 필름의 형태 에 따른 전기 저항성을 측정한 결과이다. 섬유형 필름 의 저항은 8.7 × 105 Ωm으로 치밀한 필름의 0.37 Ωm에 비해 현저하게 높은 저항, 즉 낮은 전기전도성을 나타 냈다. 이는 전기방사된 섬유사이에 존재하는 기공에 의 해 전도성이 감소된 것으로 보인다. 그럼에도 섬유형 필 름도 전기전도성을 그래핀에 의해 부여받을 수 있다는 것을 확인할 수 있었다. 문헌에서 보고하는 그래핀의 저 항은 대략 1 × 10−2 Ωm으로 알려져있다. 전도성물질로 잘 알려진 금속은 1 ~ 2 × 10−7 Ωm로 전도성이 우수하나 밀 도가 높은 물질이라 고분자와 복합화를 이룬다면 적절 한 전도성을 이끌어내기 위해 매우 많은 부피비율의 성 분함량이 필요할 것이다. 하지만 그래핀은 잘 알려져 있 다시피, 그 구조적 특이성으로 중량대비 큰 부피를 차 지한다. 전도성 물질을 이용하여 전기적 신호를 전달하 기 위해서는 그 물질들 간의 연결성이 중요하다. 즉, 서 로 연결될 수 있는 부피비율이 매트릭스 기반물질 내에 존재해야 전기적 특성의 효과를 이루어낼 수 있는 것이 다. 이에 그래핀은 충분히 많은 비율로 PCL내에 복합 화될 될 수 있었고, 이를 통해 G/PCL 복합체의 전기적 특성이 부여되고, 향상될 수 있었다는 것이 확인되었다.
3.4 세포거동 분석
제조된 G/PCL 복합체의 생체적합성은 PC21 신경세포 를 이용해 평가하였다. Fig. 5는 시료위에서 24시간 동 안 배양된 세포의 형태를 보여주는 형광현미경 이미지 들이다. PCL 로만 구성된 전기방사 섬유형 필름에서의 세포형태는 PC21 세포의 신경돌기가 뻗지 않고 둥근 형 태로 시료에 부착되어 있었다. 이러한 세포 부착 형상 은 1 %의 그래핀이 함유된 조성에서도 동일하게 나타났 다. 5 % 그래핀이 포함된 시료에서는 세포의 뻗음이 조 금 더 관찰되었으며, 그래핀이 50 %까지 증가될 때까지 세포의 퍼짐과, 신경돌기의 성장과 같은 모습이 더 빈 번하게 관찰되었다. 하지만 25 % 이상의 그래핀이 함유 된 조성에서는 부착된 세포의 수가 줄어든 현상이 발견 되었다. 이를 좀 더 자세히 관찰하기 위해 MTS assay 를 수행하였다. 이 결과를 통해 세포의 대사과정의 활 동성, 즉 세포증식과 연관된 현상을 관찰할 수 있었다. 1일 동안의 증식에서는 25 % 이상의 그래핀 조성을 갖 는 시료가 조금 낮은 증식레벨을 나타냈다. 하지만 6일 동안의 결과에서는 25 % 그래핀 조성은 빠른 증식률을 보여서 5 %, 10%의 그래핀 조성의 시료와 동일한 수 준의 증식률을 보여주었다. 단일 PCL조성과 1 % 그래 핀 조성은 세포부착이나, MTS결과에서도 동일한 결과를 보여주었다. 이중 50 % 조성은 6일동안 결과에서 가장 낮은 증식거동을 보였다. 모든 조성에서 세포독성의 소 견은 나오지 않았지만, 조직공학적 의료용 소재로 적용 하기에 우수한 조성은 5 ~ 25% 이내의 그래핀 조성을 갖는 소재를 사용하는 것이 적합하다는 것이 확인되었다.
Fig. 6
Cell proliferation of G/PCL composite films with difference graphene compositions. ***p < 0.001.
그래핀을 PCL과 복합화한 섬유제작은 기연구가 존재 하나, 이들 연구에서 그래핀 조성은 2 % 이내로 포함된 경우가 대부분이라 부여된 전기적인 특성이 약하고, 또 한 신경세포의 생체활성도가 단일 PCL성분으로 이루어 진 섬유와 비교했을 때 두드러진 향상을 보이지 않는다. 더욱이 일방향성을 갖는 모폴로지는 신경세포의 성장과 분화를 촉진하는 역할을 할 수 있는데, 기존 연구들에 서는 미방향성 섬유제작이 주를 이룬다. 본 연구에서는 두 가지의 적용분야를 나누어 사용가능한 G/PCL 복합 체 섬유를 제안하기 위해 그래핀을 최대한 높게 함유할 수 있는 일방향성 섬유제작을 연구하였다. 이에 적은 그 래핀 조성비를 갖는 소재는 그래핀이 고분자섬유의 기 계적 특성의 향상을 위한 보강재로 사용되어 치주 혹은 근육 관련 조직재생에 적용되기 적합하고, 높은 그래핀 조성의 섬유는 기계적 특성은 요구되지 않고 우수한 전 기적 특성의 효과를 얻을 수 있는 신경조직재생용 바이 오소재로 적용가능할 것이라 판단하였다.22-24) 결과들을 종 합해보면, 보편적인 조직공학체, 조직재생 유도용 차폐막 등에 적용하기에 가장 적절한 조성은 강직하고, 우수한 생체적합성을 보여준 5 % 그래핀을 함유한 복합체로 보 여진다. 하지만 전기장이나 전극 같은 외부자극을 도입 하는 시스템에 적용하여 조직재생의 시너지 효율을 이 끌고자 한다면, 25 % 조성의 복합체가 섬유의 형태학적 분석에서도 안정적인 섬유형태를 보이며, 생체적합성도 우 수하고 전기전도성의 향상도 두드러지는 조성이므로 가 장 적합하다고 사료된다.
4. 결 론
본 연구에서는 매우 소량에서 대량의 그래핀이 함유된 전기방사형 섬유 필름을 제조하고, 그들의 물리, 기계, 생 체적 특성을 분석하였다. 기계적 물성에서 1 %의 그래 핀 함유 필름은 아주 두드러지는 연신율을 보여주었고, 5 % 그래핀 함유 필름이 가장 우수한 강직성과 강도 특 성을 보였다. 전기적 특성은 그래핀 함유량이 10 %까지 는 두드러지는 현상이 없었으나, 그 이후 조성부터는 그 래핀의 함유량이 증가될수록 전기적 특성도 강화되었다. 종합적인 결과에서 우수한 생체적합성과 기계적 특성을 이용한 조직공학체의 적용에는 5 %이내의 그래핀 조성 의 복합체가 적합하고, 그래핀 조성이 25 % 이상의 경 우는 기계적 특성의 이점은 크게 없으나 전기적 특성을 이용하기엔 적합하다는 것이 확인되었다.
