1. 서 론
2. 실험 방법
2.1. 콜라겐의 추출과 막의 제조
2.2. 리보스-EDC/NHS 이중 가교의 최적 조건 확립
2.3. 리보스-EDC/NHS 이중 가교 기반 콜라겐 차폐막(RENC)의 제조
2.4. 표면 및 물리화학적 특성 분석
2.5. 기계적 특성 평가
2.6. 효소 분해 거동 평가
2.7. 세포적합성 평가
2.8. 피하 이식 및 조직학적 평가
2.9. 통계 분석
3. 결과 및 고찰
3.1. 리보스-EDC/NHS 이중 가교의 최적 조건
3.2. RENC의 표면 구조 및 화학･열적 특성에 미치는 이중 가교의 영향
3.3. RENC의 기계적 안정성 및 효소 분해 저항성에 미치는 이중 가교의 영향
3.4. RENC의 L-929 세포적합성에 미치는 이중 가교의 영향
3.5. RENC의 체내 잔존막 거동 및 국소 조직 반응에 미치는 이중 가교의 영향
4. 결 론
1. 서 론
치주조직유도재생술(guided tissue regeneration, GTR)과 골유도재생술(guided bone regeneration, GBR)은 치주조직 및 치조골 결손부(periodontal and alveolar bone defects)의 재생을 유도하기 위해 사용되는 대표적인 재생 술식이다.1,2) 이러한 술식에서 차폐막(barrier membrane)은 상피조직과 결합조직의 결손부 침투를 억제하고, 치주인대세포 또는 골형성세포가 재생 공간 내에서 기능할 수 있도록 보호된 공간을 유지하는 역할을 한다.2,3) 특히, 흡수성 차폐막(resorbable barrier membrane)은 2차 제거 수술이 필요하지 않다는 장점이 있으며, 그중 콜라겐 기반 차폐막(collagen-based barrier membrane)은 생체적합성, 낮은 면역원성, 지혈성, 세포 친화성 및 조직 통합성 측면에서 널리 활용되고 있다.3,4) 그러나 콜라겐 차폐막은 체내 효소 환경에서 빠르게 분해될 수 있으며, 조기 흡수는 재생 기간 동안 차폐 기능을 충분히 유지하지 못하게 하는 원인이 될 수 있다.5,6,7) 특히, 추출･재구성 콜라겐 차폐막은 피부와 같은 콜라겐 함유 원료 조직(source tissue)으로부터 콜라겐을 추출･정제한 뒤, 용해, 재구성, 동결건조 및 압축 등의 공정을 통해 제조되므로, 조직 내에 존재하던 고유한 세포외기질(extracellular matrix, ECM) 구조와 콜라겐 섬유 배열을 완전히 유지하기 어렵다.8,9,10) 따라서 추출 콜라겐 기반 차폐막에서는 기계적 안정성과 효소 분해 저항성을 향상시키기 위한 추가적인 기질 안정화 전략이 필요하다.11)
콜라겐 기질(collagen matrix)의 안정성을 향상시키기 위한 대표적인 방법으로 가교 처리(crosslinking)가 사용된다. 리보스(ribose)는 환원당으로서 콜라겐의 아미노기와 비효소적 당화 반응을 유도하며, 이 과정은 쉬프 염기(Schiff base) 및 아마도리 생성물(Amadori product) 형성을 거쳐 최종당화산물(advanced glycation end products, AGEs) 관련 가교 결합 형성으로 이어질 수 있다.12,13) 이러한 리보스 기반 당화 반응은 콜라겐 기질의 강성 증가와 효소 분해 저항성 향상에 기여할 수 있다.12,14) 한편, 1-ethyl-3-(3-dime thylaminopropyl) carbodiimide/N-hydroxysuccinimide (EDC/ NHS)는 콜라겐의 카복실기와 아미노기 사이의 아마이드 결합(amide bond) 형성을 유도하는 zero-length 가교 시스템으로, 콜라겐 기질의 구조 안정성과 효소 분해 저항성을 조절하는 데 활용될 수 있다.15,16)그러나 각 단일 가교법의 효과는 가교제 농도와 반응 조건에 따라 달라질 수 있으며, 하나의 가교법만으로 기계적 특성, 효소 분해 저항성 및 세포적합성을 동시에 조절하는 데에는 조건 의존적인 한계가 있을 수 있다.11,16,17,18) 특히, 리보스 기반 당화 가교는 콜라겐 기질의 강성 및 구조적 안정성 향상에 기여할 수 있는 반면, EDC/NHS 기반 화학적 가교는 아마이드 결합 형성을 통해 효소 분해 저항성을 강화하는 데 기여할 수 있다.12,13,14,15,16,18) 따라서 서로 다른 반응 경로를 갖는 두 가교법을 순차적으로 적용하면, 리보스 가교에 의한 기질 보강과 EDC/NHS 가교에 의한 분해 저항성 향상이 상호보완적으로 작용하여 단일 가교에서 나타날 수 있는 성능상의 제한을 보완할 가능성이 있다. 다만 이러한 이중 가교 조건 역시 가교 정도에 따라 기계적 특성, 분해 거동 및 세포 반응이 달라질 수 있으므로, 구조적 안정성과 세포적합성을 함께 고려하여 조건을 설정할 필요가 있다.11,16,17)
본 연구에서는 리보스 및 EDC/NHS 단일 가교에 대한 단계적 예비검토를 바탕으로 대표 농도조건을 선정하고, 이를 순차적으로 조합한 이중 가교가 돼지 피부 유래 추출･재구성 제1형 콜라겐 차폐막의 기계적 안정성, 효소 분해 저항성 및 세포적합성 간 균형을 확보할 수 있는지 확인하고자 하였다. 본 연구의 차별점은 개별적으로 알려진 리보스 기반 당화 가교와 EDC/NHS 기반 화학적 가교를 순차적으로 조합하고, 단일 가교 예비검토와 다중 성능평가를 바탕으로 이중 가교 조건을 설정한 후 이를 추출･재구성 콜라겐 차폐막의 체외 특성과 피하 이식 후 체내 거동 평가까지 연계한 데 있다. 이를 위해, 리보스-EDC/NHS 이중 가교의 최적 조건을 확립하고 이를 콜라겐 막에 적용하여 리보스-EDC/NHS 이중 가교 기반 콜라겐 차폐막(ribose- EDC/NHS dual-crosslinked collagen barrier membrane, RENC)을 제조하고 이들의 미세구조, 화학적 구조, 열적 특성, 기계적 특성, 효소 분해 거동, 세포적합성 및 피하 이식 후 잔존막 거동과 국소 조직 반응을 분석하였다.
2. 실험 방법
2.1. 콜라겐의 추출과 막의 제조
본 연구에 사용된 돼지 피부 유래 제1형 콜라겐(porcine skin-derived type I collagen)은 선행 특허(KR Patent No. 10-2023-0125170)에 기재된 방법을 기반으로 한 (주)덴티스(Dentis Co., Ltd., Daegu, Republic of Korea)의 자체 공정을 일부 변형하여 추출･정제하였다. 돼지 피부는 아세트산(acetic acid, Daejung Chemicals & Metals Co., Ltd., Siheung, Republic of Korea) 용액에서 팽윤시킨 후, 수산화나트륨(NaOH, Duksan Pure Chemicals Co., Ltd., Ansan, Republic of Korea)을 이용하여 비콜라겐성 단백질(non-collagenous proteins)을 제거하였다. 이후 펩신(pepsin, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 처리, 염화나트륨(NaCl, Daejung Chemicals & Metals Co., Ltd.)을 이용한 염석(salting-out) 및 정제 과정을 거쳐 제1형 콜라겐을 확보하였다.
비가교 콜라겐 막(non-crosslinked collagen membrane, COL)은 추출･정제된 제1형 콜라겐을 아세트산 용액에 용해한 후, 제조 주형에 분주하고 동결건조(freeze-drying) 및 압축(compression) 공정을 거쳐 막 형태로 제조하였다. 제조된 COL은 리보스-EDC/NHS 이중 가교 처리 전의 비가교 대조군으로 사용하였다.
2.2. 리보스-EDC/NHS 이중 가교의 최적 조건 확립
리보스-EDC/NHS 이중 가교의 최적 조건을 확립하기 위해 리보스 기반 당화 가교(ribose-mediated glycation crosslinking)와 EDC/NHS 기반 화학적 가교(EDC/NHS-mediated chemical crosslinking)의 농도 조건을 조합하여 예비 조건 검토하였다. 리보스(ribose, Sigma-Aldrich)는 0.01-0.10 M 범위에서 적용하였고, EDC (Daejung Chemicals & Metals Co., Ltd.) 및 NHS (Daejung Chemicals & Metals Co., Ltd.)는 각각 0.01-0.10 M 및 0.007-0.070 M 범위에서 적용하였다. 각 후보 조건은 동일한 콜라겐 막 제조 공정을 기반으로 적용하였다. 콜라겐 막 제조 과정에서는 콜라겐 용액 농도, 제조 주형 내 콜라겐 용액 분주량, 동결건조 조건과 압축 조건을 모든 후보군에서 동일하게 적용하였다. 또한, 가교 처리 과정에서는 시료 크기 대비 가교 용액량, 가교 반응 온도와 시간 및 세척 조건을 동일하게 적용하였으며, 리보스와 EDC/NHS 농도만을 후보 조건별 변수로 설정하였다.
먼저 리보스 단일 가교(single crosslinking) 및 EDC/NHS 단일 가교 조건에 대한 예비 검토를 수행하였으며, 기계적 특성, 효소 분해 저항성 및 세포 생존율을 종합적으로 고려하여 후속 이중 가교 조건 비교에 적용할 대표 농도 조건을 선정하였다. 이에 따라 후속 이중 가교 조건 비교에는 리보스 0.03 M 및 0.07 M과 EDC/NHS 0.03/0.021 M 및 0.07/ 0.049 M 조합을 적용하였다.
후보조건은 기계적 특성, 효소 분해 저항성 및 세포 생존율을 기준으로 비교하였다. 기계적 특성은 인장시험을 통해 평가하였다. 효소 분해 저항성은 콜라게나아제 및 트립신 처리 후 중량 감소율을 이용하여 평가하였으며, 효소 처리 후 막의 손상과 잔존 형태를 정성적으로 관찰하였다. 세포 생존율은 L-929 마우스 섬유아세포(L-929 mouse fibroblast, NCTC clone 929, KCLB No. 10001, Korea Cell Line Bank, Seoul, Republic of Korea)를 이용한 용출액 기반 MTT (3-[4, 5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 분석을 통해 평가하였다.11,16,17,19)
2.3. 리보스-EDC/NHS 이중 가교 기반 콜라겐 차폐막(RENC)의 제조
RENC는 COL 제조 공정을 기반으로 하되, 2.2절에서 선정한 최적 조건을 적용하여 제조하였다. 리보스 기반 당화 가교에는 0.03 M 리보스(ribose, Sigma-Aldrich)를 사용하였으며, 리보스를 콜라겐 용액에 첨가한 후 동결건조 및 압축 공정을 거쳐 막 형태로 제조하였다.
제조된 막은 0.07 M EDC (Daejung Chemicals & Metals Co., Ltd.) 및 0.049 M NHS (Daejung Chemicals & Metals Co., Ltd.)를 50 % (v/v) 에탄올(ethanol, Daejung Chemicals & Metals Co., Ltd.) 수용액에 용해하여 제조한 가교 용액에 침지한 후, 20 °C에서 24 h 동안 반응시켰다. 에탄올/물 용액은 수용액 조건에서 발생하는 EDC 가수분해 속도와 콜라겐 카복실기의 반응성에 영향을 주어 EDC/NHS 가교 반응을 조절할 수 있는 것으로 보고되어 있다.20) 가교 처리된 시료는 잔류 가교제(residual crosslinking agents) 및 반응 부산물을 제거하기 위해 초순수에 15 min 침지하는 세척 과정을 5회 반복하였으며, 이후 재동결건조하여 최종 RENC 시료로 준비하였다.
소의 심막 유래 차폐막(bovine pericardium-derived barrier membrane, BP)은 (주)덴티스(Dentis Co., Ltd.)로부터 제공받아 비교군으로 사용하였다. 모든 시료는 실험 전 각 평가 목적에 맞는 크기로 절단하여 사용하였다.
2.4. 표면 및 물리화학적 특성 분석
RENC의 표면 미세구조(surface morphology)는 주사전자현미경(scanning electron microscope, SEM, AIS2300C, Serontech, Uiwang, Republic of Korea)을 이용하여 관찰하였다. 건조된 시료는 이온 스퍼터 코터(ion sputter coater, HC-21, Hoyeon Tech, Seongnam, Republic of Korea)를 이용하여 금(Au) 코팅한 후 분석하였다. SEM 관찰은 가속전압 20 kV, 이차전자(secondary electron, SE) 모드에서 수행하였으며, 300× 배율에서 이미지를 획득하였다.
COL, RENC 및 BP의 콜라겐 관련 주요 아마이드 흡수대 양상은 푸리에 변환 적외선 분광분석(fourier transform infrared spectroscopy, FT-IR)을 통해 비교하였다. FT-IR 분석은 가교 정도를 정량적으로 평가하기 위한 목적이 아니라, COL과 RENC의 스펙트럼을 비교하여 이중 가교 처리 후 콜라겐 관련 주요 아마이드 흡수대 양상에 뚜렷한 변화가 나타나는지를 간접적으로 확인하기 위해 수행하였으며, BP는 조직 유래 콜라겐 차폐막 비교군으로 함께 분석하였다. 분석은 FT-IR/NIR 분광기(FrontierTM FT-IR/NIR Spectrophotometer, PerkinElmer, Inc., Shelton, CT, USA)를 이용하여 감쇠전반사(attenuated total reflectance, ATR) 방식으로 수행하였다. 측정 범위는 4000-400 cm-1, 분해능은 4 cm-1, scan 수는 16회로 설정하였으며, 콜라겐 관련 주요 amide I, II 및 III 흡수대 영역을 중심으로 스펙트럼을 비교하였다.
열분해 거동은 열중량분석(thermogravimetric analysis, TGA)을 통해 평가하였다. 각 시료 약 2 mg을 platinum pan에 넣고, 열중량분석기(thermogravimetric analyzer, TGA550, TA Instruments, New Castle, DE, USA)를 이용하여 질소 분위기에서 실온부터 600 °C까지 10 °C/min의 승온 속도로 분석하였다.
열전이 특성은 시차주사열량분석(differential scanning calorimetry, DSC)을 통해 평가하였다. 각 시료 약 2 mg을 Tzero aluminum pan에 봉입한 후, 시차주사열량분석기(differential scanning calorimeter, DSC2500, TA Instruments, New Castle, DE, USA)를 이용하여 질소 분위기에서 분석하였다. 시료는 25 °C에서 평형화한 뒤 250 °C까지 5 °C/min의 승온 속도로 가열하였으며, 첫 번째 승온 과정에서 얻은 thermogram을 분석에 사용하였다.
2.5. 기계적 특성 평가
RENC의 기계적 특성(mechanical properties)은 인장시험을 통해 평가하였다. 각 시료는 길이 30 mm, 폭 10 mm의 직사각형으로 절단하였으며, gauge length는 10 mm로 설정하였다. 인장시험은 건조 상태의 시료를 대상으로 만능재료시험기(universal testing machine, UTM, AGS-10kNX, Shimadzu, Kyoto, Japan)를 이용하여 5 mm/min의 crosshead speed로 수행하였다. 각 군당 4개의 시편을 사용하였다(n = 4).
최대하중(maximum load, N)은 load-displacement curve로부터 산출하였고, 인장강도(tensile strength, MPa)는 최대하중을 각 시료의 초기 단면적(width × thickness, mm2)으로 나누어 계산하였다. 시료 두께는 버니어캘리퍼(vernier caliper, CD-15APX, Mitutoyo Corp., Kawasaki, Japan)를 이용하여 측정하였다.
2.6. 효소 분해 거동 평가
RENC의 효소 분해 거동(enzymatic degradation behavior)은 콜라게나아제(collagenase) 및 트립신(trypsin) 처리 후 중량 감소율을 측정하여 평가하였다. 각 시료는 15 × 20 mm 크기로 절단하였으며, 시험 전 37 °C에서 24 h 동안 건조한 후 초기 건조 중량()을 측정하였다.
콜라게나아제 분해 평가는 Clostridium histolyticum 유래 콜라게나아제(type I, Sigma-Aldrich)를 사용하여 수행하였다. 콜라게나아제 용액은 0.025 M 인산완충식염수(phosphate-buffered saline, PBS, pH 7.2, Gibco, Grand Island, NY, USA)에 염화칼슘(CaCl2, DUKSAN Pure Chemicals Co., Ltd., Ansan, Republic of Korea)을 첨가하여 제조하였으며, 최종 효소 농도는 50 collagen digestion units (CDU)/ mL로 설정하였다. 각 시료는 콜라게나아제 용액 3 mL에 침지한 후 37 °C, 100 rpm 조건에서 1 h 또는 3 h 동안 반응시켰다. 시료의 외관 및 잔존 형태는 콜라게나아제 처리 전과 처리 후 1 h 및 3 h에 관찰하고 촬영하였다.
트립신 분해 평가는 돼지 유래 트립신(porcine trypsin, Sigma-Aldrich)을 사용하여 수행하였다. 각 시료는 트립신 용액 10 mL에 침지한 후 37 °C, 50 rpm 조건에서 24 h 동안 반응시켰다. 시료의 외관 및 잔존 형태는 트립신 처리 전과 처리 후 8 h 및 24 h에 관찰하고 촬영하였다. 8 h 시점에는 시료를 트립신 용액에 침지된 상태로 촬영한 후, 다시 반응을 계속하였다. 8 h 시점은 외관 및 잔존 형태의 관찰에만 사용하였으며, 중량 감소율(weight loss, %)은 24 h 처리 후에만 평가하였다. 24 h 효소 처리 후 시료는 초순수로 세척하고 37 °C에서 24 h 동안 재건조한 뒤 최종 건조 중량()을 측정하였다. 중량 감소율은 다음 식을 이용하여 계산하였으며, 모든 실험은 각 군당 3개의 시편을 사용하여 수행하였다(n = 3)[식 (1)].
2.7. 세포적합성 평가
RENC의 세포적합성은 L-929 세포를 이용한 용출액 기반 MTT assay로 평가하였다. L-929 세포는 10 % fetal bovine serum (FBS, Gibco, Grand Island, NY, USA)과 1 % penicillin-streptomycin (Sigma-Aldrich)이 포함된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, Gibco)에서 37 °C, 5 % CO2 조건으로 배양하였다. 시험은 ISO 10993-5를 기반으로 수행하였다.19)
시료 용출액은 COL, RENC, BP 및 음성대조군(negative control, NC)에 대해 6 cm2/mL의 추출 비율로 배지에 침지한 후 37 °C에서 72 h 동안 반응시켜 제조하였다. NC로는 고밀도 폴리에틸렌(high-density polyethylene, HDPE) 필름을 사용하였고, 양성대조군(positive control, PC)으로는 라텍스 장갑(latex glove)을 0.2 g/mL의 추출 비율로 사용하였다.
L-929 세포는 96-well plate에 well당 1 × 104 cells로 분주하고 24 h 동안 부착시킨 후, 각 시료 및 대조군 용출액으로 교체하여 24 h 동안 추가 배양하였다. 이후 세포 형태를 광학현미경(optical microscope, AE30, Motic, Xiamen, China)으로 관찰하고, MTT 용액을 첨가하여 37 °C에서 3 h 동안 반응시켰다. 생성된 formazan은 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO, Sigma-Aldrich)로 용해하였으며, 마이크로플레이트 리더(microplate reader, SpectraMax ABS Plus, Molecular Devices, San Jose, CA, USA)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율(cell viability, %)은 NC의 흡광도를 100 %로 설정하여 다음 식에 따라 계산하였으며, 각 군당 6개의 well을 사용하였다(n = 6)[식 (2)].
2.8. 피하 이식 및 조직학적 평가
RENC의 체내 잔존막 거동(in vivo residual membrane behavior)과 국소 조직 반응(local tissue response)은 랫드(Sprague-Dawley, SD) 등쪽 피하 이식(subcutaneous implantation) 모델을 이용하여 평가하였다. 랫드 등쪽 피하 이식 모델은 골결손 부위의 해부학적･기계적 요인과 구분된 비교적 표준화된 연조직 환경에서 차폐막의 체내 잔존･분해 거동과 막-조직 계면의 국소 조직 반응을 평가하기 위해 선택하였다. 모든 동물실험은 부산대학교 동물실험윤리위원회(Pusan National University-Institutional Animal Care and Use Committee, PNU-IACUC)의 승인을 받아 수행하였다(approval number: PNU-2024-0396). 7주령 수컷 SD 랫드는 실험 전 1주일 동안 순화하였다.
피하 이식 시험은 RENC, BP 및 대조군(non-implanted control, No group)으로 구성하였다. RENC 및 BP는 15 × 20 mm 크기로 준비하여 랫드 등쪽 피하에 형성한 pocket 내에 삽입하였고, No group은 동일하게 피하 포켓을 형성하되 시료를 삽입하지 않았다. 각 평가 시점마다 SD 랫드 4마리를 사용하여 총 16마리를 평가하였으며, 각 개체당 2개의 피하 포켓을 형성하였다. 각 시점에서 No group에는 2개, RENC 및 BP에는 각각 3개의 피하 포켓을 배정하였다.
이식 후 4, 8, 12 및 16주에 동물을 희생한 뒤, 이식 부위와 주변 피하조직을 함께 적출하였다. 적출 조직은 육안 관찰을 통해 잔존 시료의 형태, 경계 및 이상 소견을 확인한 후, 10 % 중성 완충 포르말린(10 % neutral buffered formalin)에 고정하였다. 고정된 조직은 파라핀 포매 후 4 µm 두께로 절편화하였으며, 헤마톡실린-에오신(hematoxylin and eosin, H&E) 염색을 수행하였다. 염색된 조직 절편은 광학현미경(optical microscope, Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)으로 관찰하였다.
잔존막 면적(residual membrane area)은 H&E 염색 이미지에서 ImageJ software (version 1.52a, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)를 이용하여 정량하였다. 스케일바(scale bar)를 기준으로 이미지를 보정한 후, 잔존막 영역을 관심 영역(region of interest, ROI)로 설정하여 면적을 mm2 단위로 산출하였다. 잔존막 면적 분석에서는 각 피하 이식 부위에서 측정한 값을 하나의 관측값으로 사용하였으며, No group은 잔존막 면적 분석에서 제외하였다. 각 시점별 RENC 및 BP의 정량 분석에는 군당 3개의 이식 부위가 포함되었다.
국소 조직 반응은 H&E 염색 조직 절편에서 막-조직 계면부를 중심으로 반정량 평가(semi-quantitative scoring)하였다. 평가 항목은 염증세포 침윤(inflammatory cell infiltration), 섬유성 조직 반응(fibrous tissue response) 및 섬유성 피막 형성(fibrous capsule formation), 괴사(necrosis) 또는 기타 이상 조직 반응(adverse local tissue reaction)으로 설정하였다. 각 항목은 0-4점 척도에 따라 평가하였으며, 0점은 없음, 1점은 최소, 2점은 경도, 3점은 중등도, 4점은 중증으로 정의하였다. 각 시점별 RENC 및 BP의 평가에는 군당 3개의 이식 부위를 사용하였다.
2.9. 통계 분석
통계 분석은 IBM SPSS Statistics for Windows (version 31.0.2.0, IBM Corp., Armonk, NY, USA)를 이용하여 수행하였다. 반정량적 조직학적 평가 점수를 제외한 모든 정량 데이터는 평균 ± 표준편차(mean ± standard deviation, mean ± SD)로 표시하였다. 두 군 간 비교에는 independent t-test를 사용하였고, 세 군 이상 비교에는 일원분산분석(one-way analysis of variance, one-way ANOVA) 및 Bonferroni post hoc test를 사용하였다. 피하 이식 후 잔존막 면적은 각 이식 부위에서 얻은 값을 이용하여 막 종류(RENC 및 BP)와 이식 기간(4, 8, 12 및 16주)을 요인으로 설정한 이원분산분석(two-way ANOVA) 및 Bonferroni post hoc test로 탐색적으로 분석하였다. 동일 동물 내에 형성된 복수 포켓 간 상관성을 반영한 혼합효과모형은 적용하지 않았으므로, 해당 분석 결과는 이식 부위 수준의 탐색적 결과로 해석하였다. 모든 통계 분석에서 p < 0.05인 경우 통계적으로 유의한 차이가 있는 것으로 판단하였다. 국소 조직 반응에 대한 반정량적 평가 점수는 군당 3개의 이식 부위에서 얻은 값으로 중앙값[최소값-최대값]을 산출하였으며, 동일 동물 내 군집구조와 제한된 표본수를 고려하여 별도의 추론통계는 수행하지 않았다.
3. 결과 및 고찰
3.1. 리보스-EDC/NHS 이중 가교의 최적 조건
리보스-EDC/NHS 이중 가교의 최적 조건을 확립하기 위해, 리보스 단일 가교 및 EDC/NHS 단일 가교에 대한 예비 검토를 바탕으로 후속 이중 가교 조건 비교에 적용할 대표 농도 조합을 선정하였다. 가교 후보조건은 기계적 특성, 효소 분해 저항성 및 세포 생존율을 기준으로 종합적으로 비교하였다. 기계적 특성은 GTR 및 GBR 과정에서 차폐막의 구조적 안정성과 재생 공간 유지에 관련된 기초 물성을 비교하기 위해 선정하였으며, 후보조건에 따른 파단 저항성의 차이를 최대하중과 인장강도를 통해 평가하였다.2,3,11) 효소 분해 저항성은 콜라겐 차폐막이 조직 재생에 필요한 기간 이전에 조기 분해될 경우 차폐 기능이 상실될 수 있다는 점을 고려하여 선정하였다. 효소 분해 저항성은 콜라게나아제 및 트립신 처리 후 중량 감소율을 정량적으로 측정하고, 효소 처리 후 막의 손상과 잔존 형태를 정성적인 보조자료로 함께 고려하였다.5,7,11) 세포 생존율은 가교 처리에 따른 기계적 특성과 효소 분해 저항성의 변화가 세포 반응의 저하와 동반되는지를 확인하기 위해 평가하였다. 콜라겐의 가교조건은 콜라겐-세포 간 상호작용과 세포 반응에 영향을 줄 수 있으므로,16,17) L-929 세포를 이용한 용출액 기반 MTT 분석을 통해 각 후보조건에서 세포 생존율의 감소 여부를 확인하였다.19)
리보스 단일 가교 예비검토에는 0.01, 0.03, 0.07 및 0.10 M 리보스를 적용하였다. 인장강도는 0.01, 0.03, 0.07 및 0.10 M에서 각각 9.18 ± 0.92, 19.70 ± 2.06, 17.77 ± 1.29 및 15.80 ± 1.27 MPa로 나타났으며, 0.03 M 조건에서 가장 높은 값을 보였다. 콜라게나아제 3 h 처리 후 중량 감소율은 각각 90.06 ± 1.10, 85.36 ± 2.13, 83.96 ± 5.20 및 77.74 ± 2.39 %였고, 트립신 24 h 처리 후 중량 감소율은 각각 98.96 ± 0.73, 97.83 ± 1.40, 93.60 ± 1.38 및 84.10 ± 4.00 %로 나타났다. 리보스 농도가 증가함에 따라 효소 처리 후 중량 감소율이 일부 낮아졌으나, 모든 조건에서 장시간 효소 처리 후 비교적 높은 중량 감소율이 관찰되어 리보스 단일 가교만으로 충분한 효소 분해 저항성을 확보하는 데에는 제한이 있었다. 세포 생존율은 0.01, 0.03, 0.07 및 0.10 M에서 각각 96.71 ± 6.36, 94.47 ± 6.71, 90.36 ± 2.69 및 70.17 ± 2.69 %로 나타났다. 0.01 M 조건은 기계적 특성 및 효소 분해 저항성의 개선이 제한적이었고, 0.10 M 조건은 효소 분해 저항성이 상대적으로 향상되었으나 세포 생존율이 감소하였다. 이에 따라 리보스 단일 가교군 중 가장 높은 인장강도를 나타낸 0.03 M과, 0.03 M보다 낮은 효소 처리 후 중량 감소율을 보이면서 90 % 이상의 세포 생존율을 유지한 0.07 M을 후속 이중 가교 비교를 위한 리보스 후보조건으로 선정하였다. EDC/NHS 단일 가교 예비검토에는 0.01/ 0.007, 0.03/0.021, 0.07/0.049 및 0.10/0.070 M의 EDC/NHS를 적용하였다. 인장강도는 0.01/0.007, 0.03/0.021, 0.07/ 0.049 및 0.10/0.070 M에서 각각 2.65 ± 0.32, 11.24 ± 0.73, 13.65 ± 1.41 및 15.52 ± 0.49 MPa로 나타났다. 콜라게나아제 3 h 처리 후 중량 감소율은 각각 98.01 ± 0.88, 39.40 ± 4.22, 13.10 ± 2.69 및 9.03 ± 2.21 %였고, 트립신 24 h 처리 후 중량 감소율은 각각 95.80 ± 2.69, 52.05 ± 6.73, 32.85 ± 9.62 및 15.18 ± 5.21 %로 나타나 EDC/NHS 농도가 증가함에 따라 효소 분해 저항성이 향상되는 양상을 보였다. 세포 생존율은 각 조건에서 각각 97.70 ± 5.41, 95.01 ± 5.04, 93.75 ± 4.73 및 83.59 ± 5.48 %로 나타났다. 0.01/0.007 M 조건은 기계적 특성과 효소 분해 저항성의 개선이 제한적이었고, 0.10/0.070 M 조건은 가장 낮은 효소 처리 후 중량 감소율을 나타냈으나 세포 생존율이 상대적으로 감소하였다. 이에 따라 효소 분해 저항성과 세포적합성 간 균형을 나타낸 0.03/0.021 M 및 0.07/0.049 M EDC/NHS 조건을 후속 이중 가교 비교를 위한 후보조건으로 선정하였다.
후속 이중 가교 조건 비교에는 리보스 0.03 M 및 0.07 M과 EDC/NHS 0.03/0.021 M 및 0.07/0.049 M 조합을 적용하였으며, 각 조건에서 제조된 콜라겐 막의 기계적 특성, 효소 분해 저항성 및 세포 생존율을 Table 1에 요약하였다. 동일한 리보스 농도 조건에서 EDC/NHS 농도가 증가할 경우 효소 처리 후 중량 감소율이 감소하는 경향을 보였다. 특히, 0.03 M 리보스 조건에서 EDC/NHS 농도를 0.03/ 0.021 M에서 0.07/0.049 M으로 증가시켰을 때, 콜라게나아제 3 h 처리 후 중량 감소율은 28.49 ± 4.62 %에서 13.88 ± 5.61 %로 감소하였고, 트립신 24 h 처리 후 중량 감소율은 51.25 ± 3.52 %에서 34.64 ± 2.62 %로 감소하였다. 반면 세포 생존율은 97.67 ± 4.14 %로 유지되어, 해당 조건에서 효소 분해 저항성 향상과 세포적합성이 동시에 확보되는 것으로 확인되었다. 0.07 M 리보스와 0.07/0.049 M EDC/NHS를 조합한 조건은 최대하중, 인장강도 및 효소 분해 저항성 측면에서 상대적으로 높은 값을 나타냈다. 한편, 정량 평가와 별도로 최종 이중 가교 조건의 선정 과정에서 수화 후 막의 형태와 조작성을 확인하기 위한 정성적 예비 관찰을 수행하였다. 네 가지 이중 가교 후보조건에서 제조된 막을 15 × 20 mm 크기로 절단하여 초순수에 1 min 동안 침지한 후, 15 mL conical tube의 외측 곡면에 적용하여 막의 형태 유지, 곡면과의 밀착 및 부분적인 들뜸 여부를 관찰하였다. 그 결과, 0.03 M 리보스가 적용된 조건은 곡면에 비교적 안정적으로 밀착된 반면, 0.07 M 리보스가 적용된 조건에서는 일부 영역의 들뜸 또는 표면 접촉 감소가 관찰되었다. 다만 해당 관찰에 대해서는 별도의 정량화나 통계적 비교를 수행하지 않았으므로, 수화 후 조작성을 비교하기 위한 보조적인 정성 평가 결과로만 활용하였다. 따라서 최적 조건은 최대 기계적 특성이나 최저 중량 감소율만을 기준으로 선정하지 않고, 기계적 특성, 효소 분해 저항성, 세포적합성 및 수화 후 조작성을 종합적으로 고려하여 결정하였다. 이에 따라 본 연구에서는 효소 분해 저항성을 향상시키고 세포 생존율을 유지하면서 수화 후 안정적인 조작성을 나타낸 0.03 M 리보스와 0.07/0.049 M EDC/NHS 조합을 리보스-EDC/NHS 이중 가교의 최적 조건으로 선정하였다. 선정된 이중 가교 조건의 최대하중과 인장강도는 각각 48.46 ± 9.44 N 및 27.63 ± 5.15 MPa로 나타났다. 단일 가교 예비검토 결과와 기술적으로 비교했을 때, 최종 이중 가교 조건의 인장강도는 리보스 단일 가교군의 최고값인 19.70 ± 2.06 MPa와 EDC/NHS 단일 가교군의 최고값인 15.52 ± 0.49 MPa보다 수치상 높았다. 또한 최종 이중 가교 조건의 콜라게나아제 및 트립신 처리 후 중량 감소율은 각각 13.88 ± 5.61 % 및 34.64 ± 2.62 %로, 후보조건으로 선정된 0.07/0.049 M EDC/NHS 단일 가교 조건의 13.10 ± 2.69 % 및 32.85 ± 9.62 %와 유사한 수준의 수치를 나타냈다. 세포 생존율은 97.67 ± 4.14 %로 유지되었다. 이러한 기술적 비교 결과는 선정된 이중 가교 조건이 리보스 단일 가교에서 관찰된 기계적 특성과 EDC/NHS 단일 가교에서 관찰된 효소 분해 저항성을 함께 고려할 수 있는 성능 양상을 나타냈음을 보여준다. 다만 단일 가교 조건과 이중 가교 조건 간 직접적인 통계적 비교를 수행하지 않았으므로, 이러한 결과는 두 가교법 사이의 상승효과를 입증하는 것이 아니라 조건 선정 과정에서 관찰된 수치적･기술적 경향으로 제한하여 해석할 필요가 있다. 이 조건을 적용하여 제조한 콜라겐 차폐막을 RENC로 정의하고 후속 특성 평가에 사용하였다.
Table 1.
Screening results for establishing the optimal ribose-EDC/NHS dual crosslinking condition.
Values are presented as mean ± SD. Mechanical properties include maximum load (N) and tensile strength (MPa). Collagenase weight loss was measured after 1 h and 3 h of treatment, and trypsin weight loss was measured after 24 h of treatment. EDC, 1-ethyl-3-(3- dimethylaminopropyl)carbodiimide; NHS, N-hydroxysuccinimide.
리보스 및 EDC/NHS 가교는 콜라겐 기질의 안정성을 향상시키는 방법으로 선행연구에서 적용되어 왔다. 제1형 콜라겐 겔(collagen gel)에 0-250 mM 리보스를 적용한 연구에서는 리보스 처리에 따라 콜라겐 기질의 강성 및 효소 분해 저항성이 증가할 수 있음이 확인되었다.12) 또한, 3차원 다공성 콜라겐 지지체(three-dimensional porous collagen scaffold)에 리보스 기반 당화 가교를 적용한 연구에서는 지지체의 구조적 안정성, 압축 특성 및 효소 분해 저항성이 향상될 수 있음이 보고되었다.21) EDC/NHS 가교의 경우, 카보디이미드 기반 가교가 콜라겐의 아마이드 결합 형성을 유도할 수 있음이 보고되었으며, EDC/NHS 농도 증가는 콜라게나아제 저항성을 향상시킬 수 있으나 인장 특성의 향상과 항상 비례하지는 않는 것으로 보고되었다.15,18) 이러한 선행 연구와 본 연구 결과를 종합하면, 콜라겐 가교 조건은 단순한 가교제 농도 증가보다 기질 구조, 효소 분해 저항성, 기계적 특성 및 세포 반응의 균형을 고려하여 설정할 필요가 있다.
3.2. RENC의 표면 구조 및 화학･열적 특성에 미치는 이중 가교의 영향
최적화된 리보스-EDC/NHS 이중 가교 조건이 콜라겐 차폐막의 구조적 및 물리화학적 특성에 미치는 영향을 확인하기 위해, RENC를 COL 및 BP와 비교하여 육안 관찰, SEM, FT-IR, TGA 및 DSC 분석을 수행하였다. 육안 관찰에서 COL, RENC 및 BP는 모두 독립된 시트형 막으로 관찰되었으며, 앞면과 뒷면 모두에서 뚜렷한 외관상의 붕괴는 관찰되지 않았다[Fig. 1(a, b, e, f, i, j)]. SEM 관찰 결과, COL은 비교적 불규칙하고 느슨한 섬유상 표면 구조(fibrous surface structure)를 보인 반면[Fig. 1(c, d)], RENC는 COL에 비해 상대적으로 치밀하고 균질한 표면 구조를 나타냈다[Fig. 1(g, h)]. 이는 리보스-EDC/NHS 이중 가교 처리가 추출･재구성 콜라겐 기질의 표면 구조 형성에 영향을 주었음을 시사한다. BP는 COL 및 RENC와 달리 앞면과 뒷면에서 서로 다른 표면 양상을 보였으며[Fig. 1(k, l)], 이는 소 심막 유래 콜라겐 막에서 보고된 매끄러운 표면(smooth surface)과 거친 표면(rough surface) 간 표면 특성 차이와 관련된 결과로 판단된다.22)
Fig. 1.
Gross appearance and surface morphology of COL, RENC, and BP. Gross images of the front and back sides are shown for COL (a, b), RENC (e, f), and BP (i, j). SEM images acquired at 300× magnification are shown for COL (c, d), RENC (g, h), and BP (k, l). Scale bars indicate 1 cm in gross images and 100 µm in SEM images. Abbreviations: COL, non-crosslinked collagen membrane; RENC, ribose-EDC/NHS dual-crosslinked collagen barrier membrane; BP, bovine pericardium-derived barrier membrane.
추출･재구성 콜라겐 막은 원료 조직 내의 고유한 세포외기질 구조와 섬유 배열이 제조 과정에서 재구성되므로, 조직 유래 막과는 다른 표면 미세구조를 나타낼 수 있다.8,9,10,11) 본 연구에서 RENC가 COL보다 치밀한 표면 구조를 보인 것은 이중 가교 처리에 의해 콜라겐 기질 내 분자 간 결합 또는 네트워크 안정성이 증가한 결과로 해석될 수 있다.
FT-IR 분석 결과, COL, RENC 및 BP는 모두 콜라겐 관련 주요 흡수대(absorption bands)를 보였다[Fig. 2(a)]. 수직으로 이동해 배열한 스펙트럼에서도 RENC는 아마이드 I, II 및 III 흡수대가 COL과 유사하게 유지되었으며, 뚜렷한 신규 피크의 출현이나 주요 아마이드 흡수대의 소실은 관찰되지 않았다[Fig. 2(b)]. 아마이드 I, II 및 III 흡수대는 콜라겐의 펩타이드 결합, 이차 구조 및 분자 배열과 관련된 주요 FT-IR 지표로 활용된다.8,11) 따라서 이러한 결과는 리보스-EDC/NHS 이중 가교 처리 후에도 RENC의 콜라겐 관련 주요 아마이드 밴드 양상이 전반적으로 유지되었음을 시사한다. 다만 본 연구의 FT-IR 분석은 가교 정도를 정량적으로 평가하기 위한 목적으로 수행된 것이 아니며, EDC/ NHS 가교와 리보스 기반 당화 반응에 관련된 흡수대는 기존 콜라겐 아마이드 흡수대와 중첩될 수 있으므로, FT-IR 결과만으로 가교 정도를 직접적으로 정량하기는 어렵다.12,13,14,15,16) 또한 본 연구에서는 잔존 자유 아미노기 함량 등 가교 정도를 직접 정량할 수 있는 별도의 분석을 수행하지 않았으므로, FT-IR 결과는 이중 가교 처리 후 콜라겐 관련 주요 아마이드 밴드의 유지 여부를 확인한 정성적 결과로 제한하여 해석할 필요가 있다.
Fig. 2.
FT-IR spectra of COL, RENC, and BP. (a) Overlaid FT-IR spectra from 4000 to 400 cm-1. (b) Vertically offset FT-IR spectra for clearer comparison of spectral profiles. Major collagen-related amide I, amide II, and amide III regions are indicated. Abbreviations: COL, non-crosslinked collagen membrane; RENC, ribose-EDC/NHS dual-crosslinked collagen barrier membrane; BP, bovine pericardium- derived barrier membrane.
TGA 및 DSC 분석을 통해 COL, RENC 및 BP의 열적 거동을 비교하였다(Fig. 3). TGA 곡선에서 3군은 초기 온도 영역에서 완만한 중량 감소를 보였으며, 이후 주요 열분해 구간에서 급격한 중량 감소가 관찰되었다[Fig. 3(a)]. RENC는 COL과 전반적으로 유사한 열분해 경향을 보였으나, 일부 온도 구간에서 COL과 구분되는 곡선 양상을 나타냈다. DSC 곡선에서도 COL, RENC 및 BP는 저온 영역에서 흡열 거동을 보였으며, RENC는 COL 및 BP와 구분되는 열전이 양상을 나타냈다[Fig. 3(b)]. 콜라겐 기질의 열적 거동은 수분 함량, 분자 간 상호작용, 가교 정도 및 기질 구조에 의해 영향을 받을 수 있으므로,11,16,23) 이러한 결과는 이중 가교 처리가 콜라겐 기질의 열적 특성에 영향을 주었음을 시사한다.
Fig. 3.
TGA and DSC analyses of COL, RENC, and BP. (a) TGA curves. (b) DSC thermograms. Abbreviations: TGA, Thermogravimetric analysis; DSC, Differential scanning calorimetry; COL, non-crosslinked collagen membrane; RENC, ribose-EDC/NHS dual-crosslinked collagen barrier membrane; BP, bovine pericardium-derived barrier membrane.
종합하면, RENC는 COL과 유사한 콜라겐 관련 주요 흡수대를 유지하면서도, COL보다 치밀한 표면 구조와 구분되는 열적 거동을 보였다. 이는 리보스-EDC/NHS 이중 가교 처리 후에도 추출･재구성 콜라겐 기질의 주요 아마이드 밴드 양상이 유지되는 한편, 표면 구조와 열적 거동에는 변화가 나타날 수 있음을 시사한다. 리보스 기반 당화 가교는 콜라겐 기질의 강성 및 효소 분해 저항성 향상에 기여할 수 있으며, EDC/NHS 가교는 콜라겐의 카복실기와 아미노기 사이의 아마이드 결합 형성을 통해 기질 안정성을 조절할 수 있다.12,13,14,15,16)
3.3. RENC의 기계적 안정성 및 효소 분해 저항성에 미치는 이중 가교의 영향
RENC의 기계적 안정성을 확인하기 위해 건조 상태에서 인장시험을 수행하고, COL 및 BP와 비교하였다(Fig. 4). 최대하중은 COL에서 10.30 ± 0.59 N으로 나타난 반면, RENC와 BP에서는 각각 50.08 ± 5.95 N 및 58.70 ± 2.62 N으로 나타났다[Fig. 4(a)]. 인장강도는 COL에서 7.34 ± 0.40 MPa였으며, RENC와 BP에서는 각각 24.91 ± 4.15 MPa 및 20.17 ± 0.77 MPa로 나타났다[Fig. 4(b)]. RENC와 BP는 최대하중과 인장강도 모두에서 COL보다 유의하게 높은 값을 보였다. 콜라겐 기질의 기계적 특성은 가교에 따른 분자 간 결합, 네트워크 안정성 및 기질 치밀도 변화와 관련될 수 있으며, 리보스 기반 당화 가교와 EDC/NHS 기반 화학적 가교는 콜라겐 기질의 강성 및 결합 안정성 향상에 기여할 수 있는 것으로 보고되어 있다.12,13,14,15,16) 따라서 본 연구에서 RENC가 COL보다 높은 최대하중과 인장강도를 나타낸 것은 리보스-EDC/NHS 이중 가교에 의해 추출･재구성 콜라겐 기질의 기계적 안정성이 향상된 결과로 해석된다.
Fig. 4.
Mechanical properties of COL, RENC, and BP under dry conditions. (a) Maximum load. (b) Tensile strength. Data are presented as mean ± SD. *p < 0.05 compared with the COL group. Abbreviations: COL, non-crosslinked collagen membrane; RENC, ribose-EDC/NHS dual-crosslinked collagen barrier membrane; BP, bovine pericardium-derived barrier membrane.
다만, 본 연구의 인장시험은 건조 상태에서 수행되었으므로, 실제 임상 환경에서 수화된 콜라겐 차폐막의 기계적 거동을 직접적으로 반영하는 데에는 한계가 있다. 따라서 본 연구의 결과는 건조 상태에서 시료 간 기계적 특성을 비교한 결과로 제한하여 해석할 필요가 있으며, 향후에는 RENC와 비교군(COL 및 BP)을 대상으로 습윤 상태에서의 최대하중 및 인장강도 등 기계적 특성을 추가로 평가할 필요가 있다.
콜라게나아제 처리 후 효소 분해 거동을 평가한 결과, COL은 처리 시간이 증가함에 따라 육안적으로 확인되는 막 구조가 빠르게 손상되었으며, 3 h 처리 후에는 잔존 구조가 현저히 감소하였다[Fig. 5(a-c)]. 반면 RENC와 BP는 콜라게나아제 처리 후에도 상대적으로 명확한 잔존 구조가 관찰되었다[Fig. 5(d-i)]. 중량 감소율은 1 h 처리 후 COL, RENC 및 BP에서 각각 62.99 ± 3.06 %, 4.39 ± 1.55 % 및 5.47 ± 2.08 %였으며, 3 h 처리 후에는 각각 94.52 ± 1.37 %, 13.88 ± 5.61 % 및 15.49 ± 5.68 %로 나타났다[Fig. 5(j)]. RENC와 BP는 모든 처리 시간에서 COL보다 유의하게 낮은 중량 감소율을 보였다. 콜라게나아제 처리 후 중량 감소율은 효소 분해 저항성을 비교하기 위한 정량지표로 사용하였으며, 처리 후 잔존 구조는 분해 양상을 확인하기 위한 정성적 보조지표로 활용하였다. 콜라겐 가교는 효소 접근성을 낮추거나 콜라겐 분자 간 결합 안정성을 증가시켜 효소 분해 저항성을 향상시킬 수 있는 것으로 보고되어 있다.12,13,14,15,16,17,18) 이에 따라 RENC에서 COL보다 낮은 중량 감소율과 상대적으로 명확한 잔존 구조가 관찰된 결과는 이중 가교 처리에 의해 콜라겐 기질의 콜라게나아제 분해 저항성이 향상된 결과로 판단된다.
Fig. 5.
Collagenase degradation behavior of COL, RENC, and BP. Representative gross images of COL (a-c), RENC (d-f), and BP (g-i) are shown before treatment, 1 h after collagenase treatment, and 3 h after collagenase treatment. (j) Weight loss of COL, RENC, and BP after collagenase treatment for 1 h and 3 h. Data are presented as mean ± SD. *p < 0.05 compared with COL group at the same treatment time. Abbreviations: COL, non-crosslinked collagen membrane; RENC, ribose-EDC/NHS dual-crosslinked collagen barrier membrane; BP, bovine pericardium-derived barrier membrane.
트립신 처리 조건에서도 유사한 경향이 확인되었다(Fig. 6). COL은 트립신 처리 후 뚜렷한 형태 손상과 분해 양상을 보인 반면[Fig. 6(a-c)], RENC와 BP는 상대적으로 명확한 잔존 구조가 관찰되었다[Fig. 6(d-i)]. 24 h 트립신 처리 후 중량 감소율은 COL에서 98.35 ± 0.60 %로 나타났으나, RENC와 BP에서는 각각 34.64 ± 2.62 % 및 32.56 ± 2.53 %로 나타났다[Fig. 6(j)]. RENC와 BP는 COL보다 유의하게 낮은 중량 감소율을 보였다. 트립신 처리 후에도 RENC가 COL보다 낮은 중량 감소율과 상대적으로 명확한 잔존 구조를 보인 결과는, 가교된 콜라겐 기질이 비가교 기질에 비해 단백질 분해 조건에서 높은 안정성을 나타낼 수 있다는 선행 연구 결과와 부합한다.15,16,23,24) 이러한 결과는 이중 가교가 특정 효소 조건에 한정되지 않고, 추출･재구성 콜라겐 기질의 전반적인 효소 안정성 향상에 기여할 수 있음을 시사한다.
Fig. 6.
Trypsin degradation behavior of COL, RENC, and BP. Representative gross images of COL (a-c), RENC (d-f), and BP (g-i) are shown before treatment, 8 h after trypsin treatment, and 24 h after trypsin treatment. (j) Weight loss of COL, RENC, and BP after trypsin treatment for 24 h. The 8 h time point was used for gross observation only. Data are presented as mean ± SD. *p < 0.05 compared with the COL group. Abbreviations: COL, non-crosslinked collagen membrane; RENC, ribose-EDC/NHS dual-crosslinked collagen barrier membrane; BP, bovine pericardium-derived barrier membrane.
종합하면, RENC는 COL에 비해 최대하중과 인장강도가 증가하였고, 콜라게나아제 및 트립신 처리 후에도 COL보다 낮은 중량 감소율과 상대적으로 명확한 잔존 구조를 보였다. 이는 리보스-EDC/NHS 이중 가교가 추출･재구성 콜라겐 차폐막의 기계적 안정성과 효소 분해 저항성을 동시에 향상시키는 데 효과적인 가교 전략임을 보여준다. 12,15,16,18)
3.4. RENC의 L-929 세포적합성에 미치는 이중 가교의 영향
RENC의 세포적합성을 확인하기 위해 L-929 세포를 이용한 용출액 기반 MTT assay를 수행한 후 COL 및 BP와 비교하였다(Fig. 7). 광학현미경 관찰에서 NC 처리군의 L-929 세포는 방추형의 정상적인 섬유아세포 형태를 보였으며[Fig. 7(a)], PC 처리군에서는 세포 밀도 감소와 둥근 형태의 세포가 주로 관찰되었다[Fig. 7(b)]. 반면 COL, RENC 및 BP 용출액 처리군에서는 NC와 유사한 세포 형태와 세포 밀도가 유지되었으며, 뚜렷한 세포 형태 이상은 관찰되지 않았다[Fig. 7(c-e)]. 이는 RENC 용출액이 L-929 세포의 형태 및 밀도에 뚜렷한 부정적 영향을 주지 않았음을 의미한다.
Fig. 7.
In vitro cytocompatibility of COL, RENC, and BP. Representative optical microscopy images of L-929 cells treated with extracts of NC (a), PC (b), COL (c), RENC (d), and BP (e). (f) Relative level of cell viability of NC, PC, COL, RENC, and BP measured by MTT assay. Cell viability was normalized to NC. Data are presented as mean ± SD. *p < 0.05 compared with the NC group. Scale bars in (a-e) = 50 µm. Abbreviations: NC, negative control; PC, positive control; COL, non-crosslinked collagen membrane; RENC, ribose-EDC/NHS dual-crosslinked collagen barrier membrane; BP, bovine pericardium-derived barrier membrane.
MTT 분석 결과, NC의 세포 생존율은 100.00 ± 5.47 %로 나타났으며, PC는 4.89 ± 1.46 %로 낮은 세포 생존율을 보였다[Fig. 7(f)]. 반면 COL, RENC 및 BP 처리군의 세포 생존율은 각각 102.49 ± 9.96 %, 99.32 ± 4.66 % 및 97.14 ± 6.02 %로 나타났다. RENC에서는 세포독성을 시사하는 세포 생존율 감소가 관찰되지 않았으며, 이는 리보스-EDC/ NHS 이중 가교 처리 후 용출성 성분에 의한 부정적 영향이 뚜렷하게 나타나지 않았음을 시사한다. 콜라겐 가교 조건은 기질 안정성을 향상시킬 수 있지만, 가교 정도, 처리 조건 및 세척 과정에 따라 collagen-cell interaction과 생물학적 반응에 영향을 줄 수 있는 것으로 보고되어 있다.11,16,17,18) 따라서 본 연구에서 RENC가 L-929 세포 생존율과 세포 형태를 유지한 것은 적용된 이중 가교 조건이 구조 안정성 향상과 세포적합성 유지 사이에서 비교적 적절한 균형을 보였음을 의미한다.
종합하면, RENC 용출액은 L-929 세포의 형태와 생존율에 뚜렷한 부정적 영향을 주지 않았다. 이러한 결과는 리보스-EDC/NHS 이중 가교가 추출･재구성 콜라겐 차폐막의 기계적 안정성 및 효소 분해 저항성을 향상시키면서도, L-929 세포 기반 용출액 평가에서 세포적합성을 유지할 수 있음을 보여준다.
3.5. RENC의 체내 잔존막 거동 및 국소 조직 반응에 미치는 이중 가교의 영향
RENC의 체내 잔존막 거동과 국소 조직 반응을 확인하기 위해 등쪽 피하 이식 SD 랫드 모델을 이용하여 4, 8, 12 및 16주 동안 조직학적 평가를 수행하였다(Fig. 8). 등쪽 피하 이식 랫드 모델은 콜라겐 차폐막의 체내 분해 거동, 혈관화, 조직 통합 및 국소 조직 반응을 평가하기 위한 전임상 모델로 활용되어 왔다.24,25,26) 이 모델은 비교적 표준화된 연조직 환경에서 차폐막의 잔존･분해 거동과 재료-조직 계면의 반응을 비교할 수 있다는 점에서 초기 체내 평가에 유용하다. H&E 염색 결과, No group에서는 모든 시점에서 이식막에 해당하는 잔존 구조가 관찰되지 않았으며, 피하조직 내 특이적인 이상 조직 반응은 확인되지 않았다[Fig. 8(a-d)]. 반면 RENC 이식군에서는 4주부터 16주까지 잔존막 구조가 관찰되었으며[Fig. 8(e-h)], 이식 기간이 증가함에 따라 잔존막의 크기와 경계가 점진적으로 감소하거나 불명확해지는 양상을 보였다. BP 이식군에서도 동일한 평가 기간 동안 잔존막 구조가 관찰되었으며[Fig. 8(i-l)], 시간 경과에 따른 잔존막 감소 양상이 확인되었다. 콜라겐 차폐막의 체내 잔존성은 원료 조직, 제조 공정, 가교 조건 및 이식 환경에 따라 달라질 수 있는 것으로 보고되어 있으며,24,25,26) 본 연구에서 RENC가 16주까지 잔존막 구조를 보인 것은 선택된 이중 가교 조건으로 제조된 RENC가 해당 피하 이식 환경에서 일정 기간 구조를 유지했음을 보여준다.
Fig. 8.
Representative H&E-stained images of the subcutaneous implantation sites in the No, RENC, and BP groups. Images of the No group (a-d), RENC group (e-h), and BP group (i-l) are shown at 4, 8, 12, and 16 weeks after implantation, respectively. Arrowheads indicate residual implanted membranes in the RENC and BP groups. Scale bars = 100 µm. Abbreviations: No, non-implanted control; RENC, ribose-EDC/NHS dual-crosslinked collagen barrier membrane; BP, bovine pericardium-derived barrier membrane.
잔존막 면적을 정량한 결과, RENC와 BP 모두 이식 기간이 증가함에 따라 잔존막 면적이 감소하는 경향을 보였다(Fig. 9). RENC의 잔존막 면적은 4주에서 297.59 ± 42.37 mm2였으며, 8주, 12주 및 16주에는 각각 203.96 ± 83.78, 167.15 ± 43.60 및 117.90 ± 35.17 mm2로 감소하였다. BP의 잔존막 면적은 4주에서 305.59 ± 39.27 mm2였으며, 8주, 12주 및 16주에는 각각 274.37 ± 40.64, 159.68 ± 33.45 및 158.49 ± 30.79 mm2로 감소하였다. 이식 부위 수준에서 수행한 탐색적 이원분산분석에서는 잔존막 면적에 대한 이식 기간의 유의한 영향이 확인되었으나, 막 종류 및 막 종류와 이식 기간 간 상호작용의 유의성은 확인되지 않았다. 탐색적 Bonferroni 사후 검정에서 RENC는 16주에서 4주 대비 낮은 잔존막 면적을 보였고, BP는 12주 및 16주에서 4주 대비 낮은 잔존막 면적을 보였다. 동일 시점에서 RENC와 BP 간 유의한 차이는 확인되지 않았다. 그러나 각 동물에서 2개의 피하 포켓을 평가하였고 본 분석에서는 동일 동물 내 포켓 간 상관성을 통계모형에 반영하지 못했으므로, 해당 유의성 검정 결과는 이식 부위 수준의 탐색적 결과로 제한하여 해석할 필요가 있다. 특히 군 간 유의한 차이가 확인되지 않았다는 결과만으로 RENC와 BP의 잔존막 거동이 유사하거나 동등하다고 판단할 수는 없다.
Fig. 9.
Residual membrane area of RENC and BP after subcutaneous implantation. Residual membrane area was quantified from H&E-stained sections at 4, 8, 12, and 16 weeks after implantation in the RENC (a) and BP (b) groups. The No group was excluded from the quantitative analysis. Data are presented as mean ± SD from three implantation sites per group at each time point. Implantation-site-level values were analyzed exploratorily using two-way ANOVA with membrane type and implantation time as factors, followed by Bonferroni post hoc comparisons. Because multiple pockets were formed within each animal, within-animal clustering was not accounted for in this analysis; therefore, the statistical results should be interpreted as exploratory. *p < 0.05 compared with 4-week group. Abbreviations: RENC, ribose-EDC/NHS dual-crosslinked collagen barrier membrane; BP, bovine pericardium-derived barrier membrane.
국소 조직 반응은 염증세포 침윤, 섬유성 조직 반응 및 괴사 또는 기타 이상 조직 반응을 기준으로 반정량 평가하였다(Table 2). RENC 이식군에서 염증세포 침윤 점수는 4주 및 8주에서 2 [2-2]로 관찰되었고, 12주 및 16주에서는 모두 1 [1-2]로 낮아졌다. BP 이식군의 염증세포 침윤 점수는 4주 2 [1-2], 8주 2 [2-3], 12주 2 [1-3] 및 16주 1 [1-1]로 나타났다. 섬유성 조직 반응은 RENC에서 4주, 8주 및 12주에 2 [2-2], 16주에 2 [1-2]로 관찰되었으며, BP에서도 4주, 8주 및 12주에 2 [2-2], 16주에 2 [1-2]로 나타나 두 군 모두 대체로 경도 수준의 섬유성 조직 반응을 보였다. 괴사 또는 기타 이상 조직 반응은 RENC와 BP 모두 모든 평가 시점에서 0 [0-0]으로 평가되었다.
Table 2.
Semi-quantitative histological scores for local tissue response after subcutaneous implantation.
Values are expressed as median [min-max] from three implantation sites per group at each time point. Given the limited number of implantation sites and within-animal clustering of multiple pockets, no inferential statistical analysis was performed. Inflammatory cells, inflammatory cell infiltration; fibrous response, fibrous tissue response including fibrous capsule formation; necrosis/adverse reaction, necrosis or other adverse local tissue reaction. Abbreviations: RENC, ribose-EDC/NHS dual-crosslinked collagen barrier membrane; BP, bovine pericardium-derived barrier membrane.
BP군의 염증세포 침윤 점수 중앙값은 4주, 8주 및 12주에서 모두 2였으며, 관찰된 최고점 3도 8주와 12주에서 모두 확인되었다. 따라서 8주 시점의 결과를 염증세포 침윤이 최대에 도달한 후 감소한 시간 의존적 변화로 해석하기는 어렵다. 또한 각 시점의 평가는 군당 3개의 이식 부위에서 얻은 반정량 점수에 기반하므로, 최소-최대 범위의 차이는 제한된 관찰 수와 이식 부위 간 변동의 영향을 받았을 가능성이 있다. 이에 따라 8주에 관찰된 점수 분포는 염증세포 침윤의 통계적으로 확인된 증가라기보다, 제한된 표본에서 나타난 관찰값의 변동으로 해석할 필요가 있다. 다만 본 연구에서는 H&E 염색을 이용한 반정량 평가만 수행하였으므로, 이러한 점수 분포의 차이가 나타난 구체적인 생물학적 원인을 확정하기는 어렵다.
또한 ISO 10993-6은 의료기기용 생체재료의 이식 후 국소 조직 영향을 평가하기 위한 기준을 제공하므로, 본 연구에서 사용한 H&E 기반 반정량 평가는 RENC와 BP의 국소 조직 반응을 기술하는 데 적절한 평가 방법으로 판단된다.27) 다만 피하 이식 환경은 실제 치주 또는 골결손 부위의 해부학적･생물학적 환경과 골재생 과정을 재현하지 못하므로, 본 연구 결과만으로 RENC의 임상적 차폐 기능이나 골재생 성능을 직접적으로 판단하는 데에는 한계가 있다. 따라서 본 연구의 체내 결과는 피하 이식 환경에서의 잔존막 거동과 국소 조직 반응으로 제한하여 해석해야 하며, 향후 치주 또는 골결손 모델에서 차폐 공간 유지능, 조직 통합성 및 골재생 유도능을 추가로 평가할 필요가 있다.
종합하면, RENC는 SD 랫드 피하 이식 환경에서 16주까지 잔존막 구조가 관찰되었으며, 이식 기간이 증가함에 따라 잔존막 면적이 감소하는 경향을 보였다. 반정량적 평가에서 RENC와 BP의 염증세포 침윤 점수 중앙값은 평가 시점에 따라 1 또는 2였고, 섬유성 조직 반응 점수 중앙값은 모든 시점에서 2였다. 괴사 또는 기타 이상 조직 반응은 두 군 모두 모든 평가 시점에서 0 [0-0]으로 확인되었다. 다만 잔존막 면적의 통계분석에서는 동일 동물 내 복수 포켓 간 상관성을 반영하지 못했으므로, 막 종류 및 이식 기간에 따른 비교 결과는 이식 부위 수준의 탐색적 결과로 제한하여 해석해야 한다. 따라서 본 연구 결과는 RENC가 해당 피하 이식 환경에서 일정 기간 잔존하면서 시간 경과에 따라 잔존 면적이 감소하는 거동을 나타냈음을 기술적으로 보여주지만, 막 종류 또는 이식 기간에 따른 통계적 차이를 확증하는 결과로 해석하기에는 제한이 있다. 향후 연구에서는 동물 수준의 군집구조를 반영한 연구설계와 동물 ID를 무작위효과로 포함한 혼합효과모형을 적용하여 RENC의 체내 잔존･분해 거동을 추가적으로 평가할 필요가 있다.
4. 결 론
본 연구에서는 돼지 피부 유래 추출･재구성 콜라겐 차폐막의 기능적 안정성을 향상시키기 위해 리보스 기반 당화 가교와 EDC/NHS 기반 화학적 가교를 순차적으로 적용한 RENC를 제조하고, 이를 비가교 COL 및 소 심막 유래 BP와 비교 평가하였다. 그 결과, RENC는 COL과 유사한 콜라겐 관련 주요 아마이드 밴드 양상과 세포적합성을 유지하면서, COL보다 높은 기계적 안정성과 효소 분해 저항성을 나타냈다. 또한, RENC는 SD 랫드 피하 이식 환경에서 16주까지 잔존막 구조가 관찰되었고, 이식 기간이 증가함에 따라 잔존막 면적이 감소하였다. 괴사 또는 기타 이상 조직 반응은 RENC와 BP 모두 모든 평가 시점에서 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 리보스 기반 당화 가교와 EDC/ NHS 기반 화학적 가교를 순차적으로 조합한 이중 가교 전략이 콜라겐 차폐막의 조기 분해를 제어하고, 구조 안정성과 생물학적 반응의 균형을 조절하기 위한 소재 설계 전략으로 활용될 수 있음을 시사한다. 다만, 본 연구의 체내 평가는 SD 랫드 피하 이식 모델에서 수행되었으므로, 향후 치주 또는 골결손 모델에서 RENC의 차폐 공간 유지능, 조직 통합성 및 골재생 유도능을 추가적으로 평가할 필요가 있다. 또한 실제 재생 환경에서 이중 가교 조건에 따른 장기 분해 거동과 신생 조직 형성의 균형을 검토하여, 콜라겐 차폐막으로서의 적용 가능성을 보다 구체적으로 확인할 필요가 있다.
